活体介观显微成像技术的快速发展使得大规模神经活动的动态观测成为可能。大规模高精度的神经信息使得多次重复试验之间的差异变得不容忽视。传统神经科学将多次试验的差异视为一种不受欢迎的噪音，通常通过多次试验的平均化来消减试验差异的影响。这在一定程度上可以消减生物系统和观测系统带来的噪音，同时也可能导致关键信息的丢失，尤其是在高级认知功能脑区。毕竟大脑并不是通过平均化的方式来理解世界的，在重复接受相同刺激时大脑输出都会产生不完全一致的认知感受。为进一步理解跨尺度单细胞水平的试验差异机制，介观尺度全皮层观测技术显得至关重要。

为了理解和解决单细胞水平重复试验差异的难题，北京时间2024年11月15日，清华大学戴琼海/吴嘉敏团队在《自然·通讯》（Nature Communications）发表题为“Mesoscale neuronal granular trial variability in vivo illustrated by nonlinear recurrent network in silico”的论文。文章首先提出猜想：无论是在活体动物大脑内或者计算模型中，试验间差异并不是真正的噪音，而有可能是一种神经活动的内在表征。基于该团队在2019年研发的RUSH第一代显微成像系统¹，文章提出了一种新的小鼠实验范式，构建了介观尺度成像系统和屏状核深部脑核团电刺激调控同步化系统，在进行多次重复电刺激调控和不同幅值强度调控下，同步记录全皮层范围动态神经活动响应。文中记录了12个大脑双侧皮层区域近4万单神经细胞的动态活动。建立了介观尺度单细胞神经活动提取、多模态行为学分析和电刺激同步刺激下的分析范式。活体神经活动的动态变化证明了试验差异是神经系统动态信息处理不可避免的结果，并由输入的刺激强度和刺激的影响范围调控。同时，文章构建了一种非线性循环神经网络模型，从计算仿真的角度证实了试验差异存在的机制。尽管单细胞水平的重复试验差异存在，大脑仍可以通过异质的皮层活动解码外部刺激变化，这可能是大脑灵活的读出策略以支持大脑稳定感知表征的基础。

图1. 介观全皮层神经活动与行为学记录范式

文章首先构建了在皮层2/3层特异表达GCaMP6f的转基因小鼠（Ai148d/Rasgrf-dcre）,通过一定的植入策略设计，将多通道的电刺激电极植入小鼠屏状核深部脑区，同步进行全皮层开颅骨手术，术后恢复的小鼠将参与电刺激调控下的介观神经活动观测。多模态的行为学和全皮层单细胞活动将被记录和分析。

图2. 多次重复电刺激调控下的介观神经活动变化

文中建立了多次重复电刺激调控下全皮层神经活动观测范式。脑深部核团电刺激调控被认为是一种被动的刺激输入，可以更好地避免对试验差异的产生影响的变量，比如动物的注意力状态、任务参与度、动物觉醒状态或眼球相关运动等因素，电刺激也可以更灵活的进行刺激大小的参数化调控。伴随相同刺激参数重复刺激的过程，大部分的神经元会出现激活或抑制。从单细胞和区域神经活动响应均可看到不可避免的试验差异存在，并在单细胞水平表现出更明显影响。从我们构建的非线性循环神经网络模型看到和活体大脑响应类似的结论，大部分神经元都只响应单次试验，并受到刺激前动物的运动状态影响。

图3. 不同电刺激幅值调控下的介观神经活动变化

在计算模型的设计中，外部刺激的幅值和输入神经元群体的大小这两个参数非常关键。文中在活体实验中通过调控电刺激幅值进行测试，同时将刺激能量保持在小鼠可耐受的范围内。正如预期所示，当输入电流幅值越大时，皮层中更多的神经元被调谐。试验间差异通过群体神经元之间的相关性进行了量化，当输入较大的电流时，多次试验之间相关性增强，这与模型中的观察结果一致。从可视化的能量景观图看出，当输入强度越强和参与任务的神经元数量越多时，在较短时间内会让大脑状态形成更明显的吸引子。

图4. 视觉刺激下的介观神经活动编码

为了进一步验证在视觉感官刺激下，大脑是否遵循一样的重复试验差异规律。文中设计了八种不同方向的视觉条纹刺激和不同对比度的条纹刺激，发现视觉对比度的不同感官强度刺激也遵循类似规律。随着刺激强度的增加，多次重复的试验差异变得越来越小，而这种单细胞水平的试验差异在不同脑区呈现出明显分布特性，除了视觉初级皮层大量低试验差异神经元存在外，其他脑区仍或多或少的存在这种类型的神经元分布。为进一步理解这种试验差异的存在对大脑的影响作用，文中用大脑神经元的解码精度来直接反应试验差异变化，这对于脑机接口等具有有限通道的神经记录应用至关重要。高解码精度通常意味着每个神经元或神经群的试验可变性低。文中使用位于视觉皮层中心一定半径内的神经元计算了解码精度。当跨越以视觉皮层为中心的视场时，解码精度从逐渐增加转变为平稳的下降。这也就是说，当视场跨越到其他脑区时，噪声的贡献大于信息的贡献量，在简单任务中跨越视场可能并不会带来更好的解码性能。

清华大学国研中心助理研究员肖桂花和清华大学自动化系博士生蔡烨怡为该文章共同第一作者。清华大学脑与认知科学研究院、清华大学自动化系戴琼海教授和清华大学自动化系吴嘉敏副教授为该论文共同通讯作者。清华大学自动化系张元龙博士，谢精玉博士，吴丽凡博士生，谢浩博士为本文作出了重要贡献。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-54346-3

论文代码链接：https://github.com/Cai-yy/Single-trial-variability.git.