随着近年来各种动物模型的发展，对活体观察其原生状态下的细胞间和细胞内相互作用的需求迅速增长。由于三维微环境的复杂性，细胞和细胞器在细胞培养板和多细胞生物体内表现出截然不同的行为。更重要的是，它们的功能和行为通常在不同生理或病理状态的长时程范围内表现出高速变化。然而，对活体组织的成像涉及光散射、光学像差、样本三维运动和光毒性等挑战，极大地降低了当前显微仪器在复杂环境（尤其是哺乳动物体内）的成像性能。如何快速构建先进显微成像系统一直以来都困扰着许多生物学实验室。

2022年6月29日，清华大学脑与认知科学研究院、自动化系，清华-IDG/麦戈文脑科学研究院戴琼海团队在Nature Protocols期刊发表了文章“A practical guide to scanning light-field microscopy with digital adaptive optics”的研究论文。该团队继2021年在Cell发文【1】构建DAOSLIMIT成像框架后（详见BioArt报道：Cell突破｜戴琼海团队以前所未有的时空分辨率进行哺乳动物活体长时程观测），进一步提出详尽的自适应扫描光场开源解决方案。该方案基于商用现成的光机电器件设备，作为普通宽视场荧光显微镜的拓展模块，提供了硬件，软件，图形操作界面全流程开源的扫描光场显微镜实现方案，同时也适用于其他种类的光场显微仪器，是国际上首篇高分辨率光场显微技术的指南文章，为生物学实验室构建简单实用的先进显微成像系统提供了支撑。

与传统的活体显微技术空间分辨率和角度分辨率相互制约不同，自适应扫描光场显微技术以断层摄影的方式对整个体积进行成像，提供了一种紧凑的计算解决方案。如图1所示，其通过同步振镜的高速扫描与精设计巧的重建算法，以全光子效率大幅提升成像的时空分辨率，并有效控制对活体组织的光毒性。此外，凭借高分辨率的多维空间角度信息，该方法通过获取四维全光信息将信号采集与自适应波前矫正解耦，数字地估计和校正空间非均匀像差，无需额外的波前传感器和空间光调制器。数字自适应光学框架有助于扫描光场显微技术在复杂环境中保持高分辨率和信噪比，并且对由光学失准引起的系统像差具有很强的鲁棒性。因此自适应扫描光场显微镜能够同时实现活体组织内的高速三维亚细胞分辨率观测，并且具备极低的光毒性，相比于转盘共聚焦显微镜下降了三个数量级以上。

图1. 自适应扫描光场显微仪器原理示意

作为一个计算成像框架，软件重建与硬件系统并重。当重建过程参数与图像采集过程不匹配时，自适应扫描光场显微镜就会出现重建伪影。有效的伪影诊断并进行准确的参数选择以补偿系统误差，对自适应扫描光场至关重要。该解决方案详细描述了潜在不同种类的成像伪影，以及用于校正和性能优化的各项参数，如图2所示。“条纹状”、“棋盘状”、“蜂巢状”等一系列不同图形特征的伪影都可被逐一去除。此外，为了增强对光学系统失准和设备制造差异等参数的容限，该解决方案提供了一键式校准程序，可在活体组织内实现高达衍射极限的稳健成像性能；同时提供了开源图形用户界面，用于硬件同步控制和多视角图像的实时渲染。

图2. 详尽的伪影分析与解决方案

最后，作者展示了自适应扫描光场显微技术的空间分辨率以及在不同物种中应用的典型案例，如图3所示。在多色标记的B16F10细胞、活体小鼠肝脏中迁移运动的中性粒细胞、发育中的斑马鱼胚胎等不同物种的复杂场景中，均取得高分辨率的活体三维成像性能，并捕获到丝状伪足的快速收缩过程和细胞器的动态变化。自适应扫描光场显微仪器的高时空分辨率、数字自适应校正能力和低光毒性为活体观察哺乳动物细胞间和细胞内的相互作用打开了新的大门。该解决方案将帮助研究人员通过低成本和紧凑的光学系统实现先进的成像性能，并且能够作为通用的光场成像框架，进一步支撑活体生物内不同病理或生理状态下的复杂细胞行为研究。在本文中包含了一整套完整的光路设计与机械设计架构，并提供了相应现成的商业化镜片选型参考，所有的软硬件控制与重建算法被集成到了单个图形化界面中，并留出了可以进一步修改的借口，为其他光场显微镜开发者提供了研究平台。

图3. 在不同种生物样本上的典型成像案例

清华大学自动化系博士研究生卢志为该论文的第一作者，清华大学自动化系博士生蔡烨怡、聂祎昕，本科生杨宇新共同参与了研究，清华大学自动化系、北京信息科学与技术国家研究中心、脑与认知科学研究院、清华-IDG/麦戈文脑科学研究院戴琼海教授、吴嘉敏助理教授为论文共同通讯作者。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41596-022-00703-9

https://rdcu.be/cQEoV

参考文献

[1] Wu, J. et al. Iterative tomography with digital adaptive optics permits hour-long intravital observation of 3D subcellular dynamics at millisecond scale. Cell 184, 3318-3332 (2021).[2] Lu, Z. et al. A practical guide to scanning light-field microscopy with digital adaptive optics. Nature Protocols (2022).